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[ 摘要]

近年来, 随着研究的深入, 一氧化氮(NO)越来越多的生物学功能逐渐被发现。 以往国内外很多报道都证实 NO 在抗微生物感染方面起到重要作用, 然而近年来的一些发现表明, NO 对微生物的生长还起到保护作用, 这种保护作用体现在 NO 能促进细菌的耐药及在氧化应激和压力应激时对微生物的保护等方面。 本文综述了 NO 对微生物生长影响作用的两面性 及其机制的研究进展。

随着一氧化氮(nit ric ox ide , NO)在促进血管舒张方面的 作用被发现, NO 的生理和病理作用逐渐受到人们的重视, 并 成为当前的一个研究热点。 近年来对其在感染损伤方面作 用的研究亦取得了很大的进展。 传统观点认为 NO 是抗感 染损伤的一个重要分子, 在细菌、真菌、病毒等感染中, 活化 的巨噬细胞通过产生大量 NO 来杀伤微生物。 然而最近的 一些研究表明, NO 对于微生物的生长是有保护作用的, 这种 作用体现在 NO 在不良环境下对微生物的保护。 本文将从 杀伤和保护两方面对 NO 影响微生物的生长进行阐述。

1、NO 对微生物的杀伤作用

作为活化巨噬细胞产生的一种细胞毒效应分子, NO 能 介导巨噬细胞抑制和杀伤细菌、真菌等微生物, 是机体抗感 染防御体系中的重要因子之一。 促使微生物自身体内产生 NO 也是药物发挥氧化应激作用杀伤微生物的重要机制[ 1] 。

1 .1、 NO 对细菌的杀伤作用

Nameda 等[ 2] 用β -葡聚糖和 吲哚美辛诱导小鼠腹腔感染细菌, 导致感染性休克, 在应用NOS 抑制剂后, NO 代谢产物产量下降, 小鼠的死亡率升高。 用 NOS 抑制剂 2 周后, 小鼠各器官细菌的数量明显上升 , 腹 膜细胞中 TNF -α、IL -1β 、IL -6 等的浓度上升。 Webert 等[3] 在小鼠气管内滴入铜绿假单胞菌诱导肺炎的产生, 然后 将小鼠暴露在含有一定浓度 NO 的空气中。 结果显示, 与对 照组相比, 暴露在 NO 条件下的小鼠内诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)活性下降, 但氮氧化物的水平明显上升, 细菌数量明 显减少, 白细胞浸润程度降低, 而机体的气体转换没有受到 影响。 Canthaboo 等[ 4] 用百日咳杆菌感染野生型小鼠和 iN- OS 缺失型小鼠, 结果显示 iNOS 缺失型小鼠对百日咳杆菌更 为敏感。 Eng elsman 等[ 5] 在外科手术器具材料上添加 NO 释 放涂层, 在体外实验中能有效抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆 菌、铜绿假单胞菌等的感染, 但是在体内实验中这种效果却 不明显。

1.2、NO 对真菌的杀伤作用

NO 对真菌的杀伤作用与细 菌相似。 Kim 等[ 6] 用血小板激活因子(PAF)预处理白假丝 酵母菌感染的小鼠, 导致 iNOS mRNA 和蛋白质的高表达。 当加入 NF-κB 抑制剂后, 这种效果被显著地抑制。 PAF 预 处理小鼠避免了因白假丝酵母菌感染而引起的死亡, 肾脏中 真菌的增长也变缓。 然而加入 iNOS 抑制剂后及在 iNOS 缺 失小鼠中, PAF 的这种保护作用消失。 数据显示 NO 在 PAF 诱导的保护机体抵抗白假丝酵母菌感染中发挥了重要作用。

在 NO 对微生物杀伤作用的研究中, 大量的研究集中于 机体通过巨噬细胞产生 NO 来杀伤侵袭的微生物 。 然而也 有一些研究指出, 促使微生物自身产生 NO 是药物发挥氧化 应激作用来杀伤微生物的重要机制。 Osório 等[ 7] 研究指出 NO 在甲萘醌等诱导的酵母细胞凋亡中发挥重要作用:液泡 膜蛋白 Btn1p 在酵母空泡运输精氨酸过程中发挥重要作用, BTN1 基因缺失型菌株对于甲萘醌、二酰胺、过氧化氢等引起 的氧化应激产生耐受。 实验发现, 基因缺失菌相比野生型菌 株, 药物作用后活性氧生成减少。 他们认为 BTN1 基因缺失 型菌株不能有效转运精氨酸来合成 NO , 从而减少了氧化损 伤, 而外源加入精氨酸则能够逆转这种氧化耐受。 Almeida 等[ 8] 也认为 NO 在酵母细胞凋亡过程中发挥重要作用:他们 用过氧化氢诱导酵母细胞发生凋亡, 从中检测到 NOS 的活 性升高, NO 的生成增加。 这种 NO 的生成依赖于左旋精氨 酸, 在加入 NOS 抑制剂后, 细胞 NO 生成量下降, 同时对过氧 化氢产生耐受。

1 .3、NO 对微生物杀伤作用机制

NO 是一种带有不配对 电子的气体自由基, 可与原核细胞和真核细胞内许多生物小 分子发生化学及生化反应, 包括氧化还原、离子移位和集团 修饰等[ 9] 。 生物体许多细胞如巨噬细胞、中性粒细胞都具有 iNOS , 在细胞因子的作用下这些细胞能够产生 效应分子 NO , 杀伤微生物。

在病理条件下, NO 可以直接抑制微生物的有氧呼吸能 量代谢;在高浓度时, NO 还可以与体内产生的氧自由基等反 应生成活性氮氧化合物(RNOS), 再由活性氮氧化合物发挥 抗微生物感染作用。 例如 NO 与超氧阴离子(O2 -)反应, 生 成过氧亚硝基阴离子(ONOO -)或三氧化二氮(N2 O3)等一 系列物质, 介导氧化损伤或亚硝基化损伤[ 10] 。 ONOO -可有 效地氧化蛋白质巯基、Fe/ S 中心、锌指结构、硝基化蛋白质的 酪氨酸残基等, 使许多重要的蛋白质或酶失活, 影响细胞代 谢, 并抑制呼吸链酶, 破坏线粒体结构, 使 DNA 链断裂, 对微 生物造成杀伤[ 11] 。 另外, NO 是活化巨噬细胞抑制和杀伤胞 内病菌的重要效应分子, 它可以通过诱导巨噬细胞释放肿瘤 坏死因子(TNF)、白介素(IL)等炎症介质介导免疫毒性反 应, 杀死病菌。

2、NO 对微生物的保护作用

以往关于 NO 对微生物生长影响的研究多着眼于 NO 对 微生物的杀伤方面, 然而最近的一些研究表明:NO, 尤其是 微生物自身产生的 NO, 对其抵抗外界恶劣环境、促进微生物 感染宿主, 甚至促进微生物耐药等方面发挥重要作用。

2 .1、NO 对细菌的保护作用

Johnson 等[ 12] 的研究发现, 在 植物生长组织内会有纤维二糖(植物细胞壁的一种成分)的 生成, 而一些植物致病性链霉菌属容易感染生长旺盛的植物 组织。 这些链霉菌会产生 NO 等活性氮类物质用于一种叫做 thax tomin 的生物合成, thax tomin 能够抑制植物纤维二糖 的合成, 从而破坏了细胞壁的完整性, 促进细菌感染植物组 织。 然而在此过程中 NO 的作用尚未研究清楚。

Gusaro v 等[ 13 -15] 关于 NO, 尤其是细菌内源性 NO 对细 菌的影响做了长期细致的研究, 他们用 NO 预处理枯草杆 菌, 然后加以 H2O2刺激, 结果显示用 NO 预处理细菌几秒后 再加以 H2O2刺激能够大幅提高细菌的氧化应激适应能力。 此外他们还认为内源性 NO 是维持细菌毒力和细菌在巨噬 细胞内存活的关键因素:他们比较了 NOS 缺失型和野生型 炭疽芽孢杆菌在小鼠体内的毒力以及巨噬细胞对其 DNA 的 损伤程度, 结果显示 NOS 缺失型细菌感染小鼠所需的半数 致死量明显增加, 巨噬细胞作用后 DNA 损伤也更加显著。 另外, 他们关于内源性 NO 促进细菌产生耐药性的报道更是 引起了人们的关注, 他们的研究发现:NOS 基因缺失型枯草 杆菌对于各种药物的敏感性明显上升, 而外源性加入 NO 后 细菌对药物的敏感性降低, 他们认为这种 NO 促进细菌耐药 作用具有广谱性。 Husain 等[ 16] 的研究结果与上述结果相 似, 他们研究了沙门菌属在氧化应激环境下存活的条件, 发 现用 NO 预处理细菌 , 阻断有氧呼吸电子传递链, 增加细菌 内 NADH 的含量, 能够使细菌耐受 H2O2导致的氧化应激。

2.2、NO 对真菌的保护作用

相对于 NO 对细菌的保护作 用, 关于 NO 对真菌 的保 护作用 的研 究报 道较 为少 见。 Chiang 等[ 17] 的研究表明微量的 NO 能够降低金属离子对酿 酒酵母的杀伤:他们用不同浓度的铜离子刺激酿酒酵母, 然 后加以不同浓度的 NO , 结果显示低浓度的 NO 能够降低金 属离子的毒性, 对菌体起到保护作用。 Domitr ovic 等[ 18] 也研 究了 NO 对酿酒酵母的保护作用, 他们将酿酒酵母置于不同 的温度环境及流体静力压下, 观察其对于热刺激及压力刺激 的耐受能力。 结果显示:预先用 NO 供体短时间处理酵母细 胞能够增强其耐高温和耐压力刺激的能力。

2.3、NO 对微生物保护作用机制

NO 对微生物的保护作 用是最近几年研究较为深入的一个方向。 然而其作用机制 目前尚未有统一的看法。 Gusar ov 等[ 13 -15] 认为 NO 促进细 菌耐受氧化应激的关键在于 NO 可以抑制芬顿效应。 芬顿 效应是一种在亚铁离子(Fe2+)催化下 O2 -和 H2O2相互作用 生成羟自由基(OH ·)的反应 , NO 抑制了芬顿效应, 从而减 少了对细菌具有很强杀伤作用的 OH · 的产生。 此外 NO 还 可以增强过氧化氢酶的活性, 两方面共同导致了细菌对过氧 化氢的耐受。 而 Husain 等[ 16] 并不认同此观点, 他们认为 NO 阻断 了细菌有 氧呼吸电 子传递 链, 增加了细 菌内的 NADH 的含量, 从而促进了氧化剂的还原, 阻止了氧化剂对 细菌的杀伤。 Chiang 等[ 17] 研究发现微量 NO 可以降低铜离 子对酿酒酵母菌的毒性, 认为 NO 抑制了铜离子介导的转录因 子 Mac1 的活性, 导致了对铜离子有高度亲和性的转运蛋白 Ctr1 的表达, 从而阻止了高浓度铜离子进入细胞。 Domitrovic 等[ 18] 认为 NO 增强酵母耐高温和耐压力刺激的机制并不相 同, 但共同的可能是 NO 在信号转导过程中发挥了重要作用。

3、NO 作用的双重性

NO 广泛产生于各种生物细胞中, 在哺乳动物、细菌、真菌体内均有产生。 并在各种生物信号转导过程中发挥重要 作用[ 19-20] 。 在关于 NO 与微生物生长之间关系的研究中, 人 们发现在不同的浓度、不同的环境下, NO 会对微生物的生长 造成截然不同的影响。 例如 Chiang 等[ 17] 的研究表明微量的 NO 能够激活铜离子敏感性转录因子(Ace1), 加速金属离子 的代谢, 从而降低金属离子的毒性, 对细菌起到保护作用;而 高浓度的 NO 反而抑制 Ace1, 减缓金属离子的代谢, 增加了 金属离子的毒性。 目前 NO 对微生物生长所造成的双重影 响尚待研究。 另外, 一些 NO 在微生物生长过程中起到了特 殊的作用, 例如 Barraud 等[ 21] 研究发现铜绿假单胞菌内源性 产生的 NO 能够促使细菌由菌丝态向游离态转换, 合理利用 NO 的这种性质, 将 NO 供体与杀菌药合用可以增强药物对 菌丝态细菌的杀菌效果。 此外, 不同的微生物, NO 所表现出 的作用可能也完全不同, 例如文献[ 7 ,13 -15] 关于 NO 对于真菌 和细菌耐药性的研究报道截然相反, Osó rio 等[ 7] 认为促使微 生物自身产生 NO 是药物发挥氧化应激作用来杀伤微生物 的重要机制;而 Gusaro v 等[ 13 -15] 认为微生物自身能够产生 NO 是增强细菌感染宿主, 甚至产生耐药性的重要机制。 这 似乎是两种矛盾的观点。 但仔细推敲, 凯发最新官方app下载认为是可以解释 的:外界刺激杀伤微生物时, 早期微生物自身免疫机制发挥 作用, 产生 NO , 这时的 NO 对于微生物是有保护作用的[ 14] , 而药物大量长时间刺激诱使微生物产生大量 NO, 这时的 NO 又是有杀伤作用的。 所以凯发最新官方app下载认为 NO 产生的时间、环境、 浓度不同是它表现为双刃剑作用的重要原因。 但这只是我 们的猜测, 其中的机制需要进一步的研究。 目前关于微生物 内源性 NO 的研究报道并不多见, 内源性 NO 在微生物的生 长过程中发挥着怎样的作用尚不得而知。 但凯发最新官方app下载相信, 就像 在哺乳动物体内的作用一样, NO 在微生物信号转导等方面 也发挥着独特的作用, 而且这种作用深受浓度、环境、菌种等 的影响。

对微生物来说, NO 是一把双刃剑, 在适宜的环境中 NO 对微生物起到保护作用, 而条件不适则有可能对其造成杀 伤。 更加深入地研究 NO 对微生物生长造成的影响及其机 制, 必将有利于凯发最新官方app下载寻找新的抗感染药物作用靶点和新的抗 感染治疗手段。