使用离体培养的小鼠的血管纹中间细胞，用记录离体的中间细胞的膜电位的方法，观察顺铂是否能够影响中间细胞上的离子通道和离子泵。


内淋巴电位及胞外电位的测量


动物腹腔注射麻醉剂（氯胺酮90 mg/kg+甲苯噻嗪4.5 mg/kg），麻醉满意后，在隔音屏蔽室内，将动物腹侧向上放置于保温垫上，使其体温维持于37°C。固定头部及四肢。颈部正中皮毛备皮。颈部正中切口，手术显微镜下分离皮下组织及肌肉，做气管切开。进一步分离颈部肌肉组织，并分离听泡表面附着软组织，暴露听泡。充分止血后开放听泡，充分暴露镫骨动脉，耳蜗底转。


内淋巴电位的记录方法在以前发表的文章里已有详细介绍[16-21]。凯发在线官网登录选择耳蜗底转来进行内淋巴电位测量。玻璃微电极（直径为1?m，输入阻抗10-20 MΩ）固定于微操纵器上，电极内充满150 mM KCl溶液。参考银球电极埋入同侧颈部肌肉内。使用微操纵器将玻璃微电极由圆窗插入,缓缓推进，电极与耳蜗表面接触时调整记录信号的基线为零。经鼓阶通过穿透基底膜进入中阶（图1A)后，观察到一个稳定的直流电位。使用Axopatch 200B放大器(Molecular Probe,Sunnyvale,CA)来放大电信号（滤过频率为1 kHz）。使用16位A/D转换器进行模数转换。使用pClamp10.0的软件进行信号采集。采样频率设定在10 kHz。


通常采用圆窗电极的方法记录微音电位[18-21]。凯发在线官网登录采用插入鼓阶中记录内淋巴电位的微电极记录胞外电位（即微音电位）。记录胞外电位时，凯发在线官网登录采用4kHz的短纯音，升降时间为0.1ms，时程1秒，强度为85dBSPL。声音由信号发生器产生，经放大后由扬声器（MF1-S，TDT）给出。在记录胞外电位时，用Axopatch 200B放大器放大信号，滤过频率为10kHz，采样频率为50kHz。

图1记录成年小鼠耳蜗EPFig.1 Recording EP from adult mouse cochleaeA:使用微电极通过耳蜗基底膜记录内淋巴电位(EP)的示意图。IHC：内毛细胞；OHCs：外毛细胞。B:从小鼠耳蜗底转记录到的内淋巴电位，红色箭头所指为电极插入、退出中阶的时间点。C:从小鼠耳蜗底转记录到的内淋巴电位和胞外电位。在记录内淋巴电位过程中，用4kHz的短纯音诱发胞外电位（即耳蜗微音电位）。放大的胞外电位显示在图C的插图中。

中间细胞培养


将生后5天C57BL/6J小鼠的内耳组织取出，分离出耳蜗中转、顶转的血管纹。将分离获得的血管纹组织放入预先准备好的装有DMEM的培养皿中，然后铺平将其放入到培养箱中。两个小时后加入少量胎牛血清使其浓度达到5-10%之间。次日早晨将培养皿中的培养基更换成PVM细胞专用培养基。在培养过程中，中间细胞会从血管纹中迁移出来，培养5-7天后，大部分中间细胞已经迁移出血管纹。由于其含有色素，中间细胞非常易于辨认。


使用全细胞膜片钳记录细胞静息电位


使用Olympus BX51WI正置显微镜和Axo?patch 200B放大器,来进行全细胞电压/电流钳记录。微电极使用3D的微操纵器来控制(MHW-3,Narishige,日本)。微电极是使用显微拉制仪从直径1.5 mm玻璃管(A-M Systems,Carlsborg公司)拉制而成。记录电极的电阻为3-4 MΩ,内充的溶液的成分(mM)为150 KCl,2 MgCl2,1 EGTA,10 HEPES,使用KOH将pH调节到7.3。全细胞膜片钳建立好后,整个通路的串联电阻为8-12 MΩ。