研究简介:胍是一种在自然界中广泛存在并且在人类尿液中排泄的化学稳定的氮化合物，它也被用于塑料制造、作为阻燃剂和推进剂的成分，在生物化学中作为蛋白质变性剂而知名。研究人员通过蛋白质组学、酶动力学和晶体结构分析等方法，揭示了N.inopinata中胍酶的活性和作用机制。他们发现，这种微生物能够通过一个高效的途径将胍转化为氨，这一途径不依赖于ATP（三磷酸腺苷），使其比其他已知使用胍作为氮源的微生物更有能量效率。在农业土壤和废水处理厂的微生物群落中，胍可以作为硝化作用的底物。这一发现不仅为理解comammox在氮循环中的作用提供了新的视角，也为开发新的生物技术提供了可能性，例如在废水处理和农业土壤管理中利用comammox微生物来提高氮的利用效率。探讨了胍代谢在环境中的潜在应用，包括在废水处理厂中去除广泛使用的药物如二甲双胍（一种治疗2型糖尿病的药物）的环境残留。二甲双胍的降解产物之一就是胍，因此comammox微生物可能在环境中的胍循环中发挥重要作用。本研究给出了一个突破性的发现：一种名为Nitrospira inopinata的完全氨氧化微生物（comammox）能够利用胍作为其唯一的能量、还原剂和氮源进行生长。


Unisense微呼吸系统的应用


Unisense微呼吸系统被用于测量和监测全细胞底物氧化动力学。unissense的微呼吸测量是一种用于评估微生物细胞对特定底物（如胍、尿素或氨）氧化能力的技术。使用O2 MicroOptodes和MicroOptode meter（Opto-F4 UniAmp），能够实时监测在微呼吸实验中氧气浓度的变化。向含有N.inopinata细胞的MR室中注射不同的底物（如胍、尿素或氨），测量细胞对这些底物的氧化速率，并通过氧气消耗来推断。。通过监测氧气的消耗，使用Michaelis-Menten模型来计算如Km(app)（表观半饱和常数）和Vmax（最大反应速率）等动力学参数。在氨氧化过程中添加不同浓度的胍，评估了胍对氨氧化速率的抑制效应。测量细胞在不同底物条件下的氧气摄取率，可以分析细胞的代谢活性和对不同底物的利用效率。


实验结果


发现了一种全新的微生物代谢途径，即完全氨氧化微生物（comammox）Nitrospira inopinata能够利用胍作为其生长的唯一能源、还原剂和氮源。表明comammox微生物在氮循环中可能扮演着重要角色，尤其是在胍含量丰富的环境中。胍的代谢为comammox提供了一个额外的生态位，有助于它们与其他氨氧化微生物共存。胍作为一种潜在的硝化微生物生长基质，可能有助于开发新的生物技术，在废水处理和农业土壤管理中提高氮的利用效率，以及在去除环境中的二甲双胍等药物残留方面发挥作用。研究补充了对氨氧化微生物能量来源和代谢途径的理解，特别是对于comammox微生物的生态重要性和它们在自然界中的分布。

图1、胍降解所涉及的途径和基因。a)胍羧化酶途径。AH，脲基甲酸酯水解酶；CD，羧基胍脱氨酶；气体、胍酶；GC，胍羧化酶；P i，无机磷酸盐；用途，脲酶。b）胍酶途径。c）在comammox微生物N.inopinata、AOB Nitrosospira multiformis和两种用于胍分解代谢的细菌模型生物中，编码参与在I型胍核糖开关调节下的胍降解的蛋白质的基因的排列。

图2、comammox胍酶的系统发育和结构。a，尿素水解酶超家族的系统发育。圆圈表示具有功能特征的成员。所表征的N 1-氨基丙基胍丁胺酶包含在指定的胍丁胺酶进化枝中。灰色分支不对应于任何已知的功能，或者对于功能来说不是单系的。b，简化的胍酶系统发育，使用生化特征的精氨酸酶家族成员作为外群（扩展数据图4a中显示了完整的树）。根据先前的研究（N.inopinata胍酶位置Thr105、His222、Trp313和Glu344；补充表4），显示了可能对胍催化重要的特定氨基酸残基。c，comammox胍酶（氨基酸）和氨单加氧酶（amoA核苷酸）的系统发育关系的比较。同一基因组中发现的基因的树尖相连。d，胍丁酶的静电表面表示（从?5 kT/e（红色）到+5 kT/e（蓝色）），其中突出显示了通往活性位点的隧道的建议入口（左）。右图是方框所示区域的放大图。由CAVER 57确定的隧道显示为绿线，其宽度由点表示表示。活性位点残基显示为棒，镍(Ni)和锰(Mn)离子分别显示为绿色和紫色球体。胍显示为棒，相应的范德华原子半径表示为点。

图3、N.inopinata在以胍为唯一能源、还原剂和氮的情况下生长。a，随着时间的推移，胍的生物降解。将约50μM(150?M N)同位素标记的胍添加到N.inopinata的洗涤培养物中（与胍和铵预孵育1个月后），并孵育126天。使用高压灭菌的N.inopinata生物质来控制非生物胍腐烂。在第84天和第112天，将大约50μM的胍额外添加到活生物质培养物中（灰色虚线）。铵从未增加到检测水平(5?M)以上，尿素浓度保持在2.5?M以下。b、NO 2-和NO 3-产量（组合）。孵育结束时，添加的胍氮总量的78%被氧化为NO 2-和NO 3-。氮平衡显示在扩展数据图3f中。c，16S rRNA基因拷贝数的qPCR分析。使用韦尔奇双样本t检验进行统计分析；***P=0.0049，t=10.348，df=4，比较在126天时间点使用胍与不使用胍孵育的N.inopinata细胞数量。对于a–c，数据是五个生物重复的平均值±标准差。d、e，用胍(d)和不含胍(e)孵育107天后DAPI染色的N.inopinata细胞（红色，10 ml培养物过滤到0.2?m GTTP过滤器上）的代表性图像。所有五个生物复制都观察到相同的结果。f，g，N.inopinata细胞与15 N-胍和13 C-碳酸氢盐孵育107天后的氮(f)和相应的碳(g)同位素富集（使用nanoSIMS测量）。通过用来自顶空空气的CO 2稀释13 C-碳酸氢盐、丙酮酸盐形成CO2以及介质中同位素未标记的胍的分解来降低13 C-富集。显示了来自一个生物复制的数据。

图4、纯化的胍酶和N.inopinata细胞的胍氧化动力学。a，异源表达的N.inopinata胍酶的动力学特征。Michaelis-Menten模型（红线）适合胍酶（pH 7.5，37°C）的三次胍消耗率，并用于确定K m和V max。b，用微传感器测量用胍预诱导约12小时的细胞，确定N.inopinata的全细胞胍氧化率。Michaelis-Menten模型（红线）用于根据胍氧化速率确定表观半饱和常数(K m(app))、V max和底物特异性亲和力。

图5、a、b）来自Ribe(a)和Haderslev(b)污水处理厂的大量comammox生物体中，胍APC超家族通透酶(APCP)和胍酶对底物加标（胍、铵、尿素）孵育的转录反应。Ribe和Haderslev实验的宏转录组读数分别映射到Ribe和Haderslev comammox MAG；TPM中显示了所有时间点感兴趣基因的转录水平。c、d，Ribe(c)和Haderslev(d)采样时用于宏转录组学的重复中相应的胍浓度。


结论与展望


胍是一种化学稳定的氮化合物，可通过人体尿液排出，广泛用于塑料制造、作为阻燃剂和推进剂的成分，并且在生物化学中作为蛋白质变性剂而广为人知。胍在自然界中广泛存在，并被多种微生物用作氮源，但以胍作为唯一底物生长的微生物尚未被鉴定。研究发现完全氨氧化剂（comammox）Nitrospira inopinata和可能大多数其他comammox微生物可以依靠胍作为唯一的能量、还原剂和氮源生长。N.inopinata胍酶同源物的蛋白质组学、酶动力学和晶体结构证明它是真正的胍酶。Unisense微呼吸系统被用于测量和监测全细胞底物氧化动力学，该技术的使用使得研究人员能够精确地测量微生物对特定底物的代谢反应，并进一步了解微生物的代谢途径和生态功能。Unisense微呼吸系统对于揭示N.inopinata如何利用胍作为能量、还原剂和氮源进行生长具有关键作用。再对含有comammox的农业土壤和废水处理厂微生物组进行的孵化实验表明，胍可作为环境中硝化的底物。胍作为comammox生长底物的鉴定显示了这些全球重要硝化菌的意想不到的利基，并为它们的分离提供了机会。这项研究不仅揭示了comammox微生物的新功能，也为理解微生物在氮循环中的作用提供了新的视角，并为未来的环境生物技术和生态研究开辟了新的道路。