2.材料和方法


2.1.实验程序


凯发在线官网登录取样于中国珠江三角洲容桂镇(22°450 N,113°150 E)的一条受工业和生活废水污染的城市小溪。这条小溪氧气有限,有一股特有的臭味。使用前,使用0.149-mm的筛子对凯发在线官网登录进行筛分、均质,并在25°C的暗处储存。批量试验采用以下程序:首先,在40ml棕色小瓶中构建90个微观世界,其中含有25g原始凯发在线官网登录(含水量~60%,氧化还原电位(ORP)~-200mV)和5ml消毒水。其次,将纯水(作为对照)和五剂SPC溶液(Alfa Aesar,中国)注入微宇宙,使微宇宙中的SPC含量增加到5.6、11.2、16.8、22.4和33.6 mmol SPC g-1湿凯发在线官网登录。最后,用聚四氟乙烯盖密封小瓶,立即摇动以实现均质,并在25°C的黑暗中静态储存。所有治疗均一式三份进行。在添加SPC后3小时(称为第0天)、15天、37天和50天,对五个处理组和对照组的每18个样本进行分析。


在每个取样时间点,摇动18个微观世界以实现均匀化。首先,用微电极测定pH和ORP(丹麦Unisense)。然后,提取三份0.5 g凯发在线官网登录并储存在?80°C下:一份用于测试第2.2节所述的本地微生物群落的潜在代谢活性;第二部分用于提取16S rRNA基因,以进行第2.3节所述的高通量测序;第三份用于测定酸挥发性硫化物(AVS,数据如图S1所示)。以3000 rpm离心残余凯发在线官网登录15分钟,并通过0.45-mm膜过滤上清液以获得凯发在线官网登录的液相。这用于测定溶解物质,包括硫酸盐、硝酸盐、铵、磷酸盐、无机碳(碳酸盐)和溶解有机碳(DOC)。使用离子色谱仪(Thermo-DIONEX,ICS-11OO(KOH用作流动相)和ICS-900)测试无机盐,使用TOC分析仪(Elementar Vario TOC,德国)测试DOC。


2.2.本地微生物群落潜在代谢活性的测定


如前所述,本地微生物群落的潜在代谢活性由Biolog生态板(Biolog,美国)确定(Gu等人,2014年)。简言之,将0.5 g湿凯发在线官网登录和4.5 mL 0.9%NaCl(pH?7.0)超声处理八次(每次15秒)(KQ-300DE,柯桥),然后沉淀0.5 h以从凯发在线官网登录中释放细菌。之后,提取1 mL悬浮液并添加到新的离心管中,用0.9%的盐水替换液体两次,以去除溶解物质。在600 nm处,将替换悬浮液的吸光度稀释至0.05±0.01,以确保每个样品包含大致相同的生物量浓度。最后,向ECO板的每个孔中加入150 mL稀释溶液。ECO板在30°C的黑暗中孵育。在最初12小时后,然后每24小时(直到148小时)使用微孔板读取器(Multiskan GO,Thermo)测量595 nm处的吸光度,以获得ECO板所有31个碳源的平均井色显影(AWCD)。


2.3.DNA提取、16S rRNA基因测序和分析


根据先前的研究进行了DNA提取和纯化(Fang等人,2015)。使用条形码引物314F(50eCCT ACG GGN GGC WGC AG-30)和805R(50-GAC TAC HVG GGT ATC TAA TCC-30)扩增16S rRNA基因的V3?V4高变区(Vasileiadis等人,2012年)。使用Illumina Miseq PE300作为测序平台,配对末端读数与FLASH(v2.2.00)连接在一起(Magoc和Salzberg,2011)。在Mothur(v1.39.5)(Schloss等人,2009年)中进行了质量控制,包括去除低质量读取、嵌合序列和V3?V4区域的碱基。


随后的分析在Louca(Louca et al.,2017)描述的QIIME(v1.9.0)(Caporaso et al.,2010)中进行,并进行了修改:根据97%的相似性阈值(Edgar,2010),对照SILVA数据库(版本123),将高质量序列聚类到操作分类单元(OTU)。这包括usearch的内置嵌合体检查。分类信息通过Uclust方法分配给每个OTU。在这些初步分析之后,获得了由1339个OTU组成的OTU表,其中每个样本的读数介于12777和42044之间。OTU表被细化为每个样本12777次读数,以便后续分析。


2.4.数据分析


对于多重比较,在SPSS(v20.0)中进行T检验(p<0.05*、p<0.01**和p<0.001***)和邓肯检验的方差分析(a?0.05)。进行了以下统计分析:(1)非度量多维标度(NMDS)、使用距离矩阵的排列多元方差分析(Adonis)、相似性分析(Anosim)和多反应排列程序(MRPP)。使用R studio(v3.3.2)确定微生物群落的总体变化;2)在QIIME中分析了微生物群落的α多样性值;3)采用层次聚类法比较微生物群落的分类组成;4)此外,为了将微生物群落与一个或多个感兴趣的代谢功能相关联,如Louca等人(2016)所述,使用原核生物分类群的功能注释(FAPROTAX)算法预测功能组;5)在R studio中,通过冗余分析(RDA)分析环境变量和微生物组成(被认为是属)之间的关系;6)spearman秩相关分析在R studio中进行,以调查(a)功能组和环境变量之间的关系,以及(b)功能组和所考虑的属之间的关系。


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