为了便于镜下观察，基于细胞培养的嗅球神经元是主要的实验对象之一。目前对离体嗅球神经元的电信号检测主要是膜片钳记录技术。随着微电子机械加工技术(MEMS)的发展，微电极阵列(microelectrode array，MEA)、光寻址电位传感器(light addressable potentiometric sensor，LAPS)和场效应晶体管(field effect transistor，FET)等微传感技术在生物信号检测中得到迅速发展和广泛应用。曾经将嗅球神经元培养在LAPS芯片上观察气味对僧帽细胞有无响应，作为研究嗅觉受体神经元对气味响应的实验对照。下面是操作步骤：


1.1器件准备

微电极阵列MEA的制作采用标准微电子制作工艺：5吋玻璃基底(厚度500μm)经过标准清洗后在表面磁控溅射一层厚度100～500?的Cr或Ti-W薄膜作为中间层，然后再溅射厚度为2000～5000?的Au薄膜形成电极层;溅射完成后，沉积一层聚酰亚胺或光刻胶作为绝缘层，并通过反应离子刻蚀技术(reactive ionetching，RIE)刻蚀暴露出金电极阵列图形。将器件固定在PCB座上，利用点焊技术将器件上的焊点与PCB板上的焊盘用金线连通。然后用生物相容性较好的环氧树脂覆盖焊丝，粘接测试腔，室温固化，得到如图1(a)所示的器件。

图1器件。(a)封装的器件;(b)电镀铂黑的MEA显微照片


为了降低热噪声，提高细胞胞外信号检测的信噪比，本实验对MEA金电极表面电镀铂黑颗粒，以增加电极的表面积，降低电极阻抗。电镀系统采用三电极系统与CHI660 C型电化学工作站，每个电极的电镀时间约45 s。最后得到的MEA显微如图1(b)所示，电极直径为30μm。


1.2细胞培养


嗅球细胞的培养与大多数神经元培养方法相似。将新生SD乳鼠(1～3 d)剪取鼠头，将其放入酒精中消毒1～2 min后，立即转入盛有磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)的无菌培养皿中。剪开头皮，拨开颅骨，暴露全脑。轻轻剥离两侧嗅球，放于另一无菌盛有PBS的培养皿中。轻轻剥去被膜，然后将嗅球剪成1 mm3左右的组织块，加入2 mL含10μg/L神经生长因子(nerve growth factor，NGF)的DMEM(Dulbecco＇s modified eagle＇s medium)培养液中进行吹打，制成细胞悬液，接种在MEA表面。24 h后全量换液，48 h后滴加5-氟尿嘧啶(fluorouracil，5-FU)以抑制胶质细胞的过度生长。每3 d换液一次。培养5～7 d后，可以将芯片取出进行观察和测试。


1.3染色处理


为了更加清楚地观察嗅球神经元的形态和生长状态，信号测试结束后对细胞进行染色处理。本实验采用瑞士染色法，染液包括Ⅰ和Ⅱ两组份，由碱性染料美蓝和酸性染料伊红分别配制而成。首先将细胞培养腔内的神经测试液吸干;然后滴加适量染液Ⅰ于培养腔内，保证溶液浸没细胞;1 min后将等量的染液Ⅱ滴加入培养腔，保证染液Ⅰ、Ⅱ均匀混合;大约5 min后用清水冲洗数遍;将培养腔内溶液吸干，置于显微镜下观察。


1.4信号采集与分析


利用多通道放大器(MEDl6，Multichannel systems，GmbH，德国)，本实验可以实现16通道的同步记录，采样频率为10 kHz。


为了评估嗅球细胞网络传感器的检测能力，选用嗅球内兴奋性神经递质谷氨酸(glutamic acid，Glu)进行了实验研究[19]，观察了Glu作用前后不同通道嗅球神经元的响应。Glu溶液由正常神经测试液配制而成，最终浓度为200μM。


信号的统计分析图和光栅图均通过Matlab软件完成。